酵母蛋白表达步骤/实验流程

本文主要讲述了酵母蛋白表达步骤，详细酵母表达流程。从感受态细胞制备，转化方法选择及操作，从化学试剂PEG1000 转化，电击转化，原生质体法转化三个方法入手及转化子的筛选及最终的蛋白表达，全套酵母蛋白表达标准操作流程。

质粒线性化

在酵母表达系统中已经介绍了酵母蛋白表达原理，因此线性化是酵母转化的第一步，采用不同的限制酶酶切可以得到不同的表型。

转化方法

毕赤酵母PEG1000 转化及感受态制备

配置缓冲液

1）缓冲液 A：1.0M 山梨醇，10mM 甘氨酸，pH8.35，3%（v/v）乙二醇，滤膜过滤，-20℃保存；

2）缓冲液 B：40%（w/v）PEG1000，0.2M 甘氨酸，pH8.35，滤膜过滤，-20℃保存；

3）缓冲液 C：0.15M NaCl，10mM 甘氨酸，pH8.35，滤膜过滤，-20℃保存；

4）未污染的新鲜、试剂级 DMSO，-70℃保存

将 DNA 直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源 DNA 的能力也在解冻过程中迅速下降；样品的转化，进行多组试验。

感受态制备
 

1）接种酵母受体菌单菌落于 YPD 平板（YPD：蛋白表达试剂配置），30℃培养 2 天；

2）挑取平板上的单菌落接种于 10mlYPD 液体培养基中，30℃摇床震荡过夜；

3）过夜培养后按 1%左右的接种量接种到 100mlYPD 培养基中震荡培养至 OD 值从 0.1 至 0.5~0.8；

4）3000~5000rpm 离心收集沉淀菌体，用 50ml 预冷 A 液洗涤，并重悬与 4mlA 液中；

5）根据每次使用量（0.1-0.2ml 左右）分装与 1.5ml 离心管中，每管加入 10ul 的预冷 DMSO，混合后迅速-80℃/液氮（感受态可以放到-80℃ ，但是酵母表达建议感受态现做现用）

酵母转化

1）线性化质粒 50ug（可预冷）溶于 200ul 的 TE 中，直接加入冻存的酵母感受态中；

2）37℃水浴 5min，过程混合样品 2 次；

3）取出加入 1.5ml 缓冲液 B，彻底混匀；

4）30℃水浴 1 小时；

5）室温 2000rpm 离心 10min，去上清，得沉淀，重悬菌体与 1.5ml 缓冲液 C 中；

6）再次离心，去上清，得沉淀，轻轻加入 0.2ml 缓冲液 C 重悬；

7）将重悬的转化液涂与选择性培养基（根据抗性配置）中，30℃孵育 3-4 天，进行鉴定。

毕赤酵母电击感受态细胞制备及转化

感受态制备

1）接种酵母受体菌单菌落于 YPD 平板，30℃培养 2 天；

2）挑取平板上的单菌落接种于 10mlYPD 液体培养基中，30℃摇床震荡过夜；

3）过夜培养后按 1%左右的接种量接种到 100mlYPD 培养基中震荡培养至 OD 值 1.2~1.5；

4）4℃，5000rpm 离心 5min 收集沉淀菌体，用 100ml 预冷无菌水重悬菌体；

5）4℃，5000rpm 离心 10min 收集沉淀菌体，用 100ml 预冷无菌水重悬菌体；

6）再次 4℃，5000rpm 离心 10min 收集沉淀菌体，用 100ml 预冷无菌水重悬菌体；

7）20ml，1mol/L 山梨醇洗涤 1 次；

8）将菌体溶于 200ul，1mol/L 预冷山梨醇中，不加甘油，-80℃放置几小时，待转化

酵母电转

1）准备好 80ul 的酵母感受态与线性化的质粒 1-5ug（冰上预冷 15min）混合，迅速放入 0.2cm 的电击杯中（电击杯冰上预冷灭菌），电击；

2）电击结束，迅速加入 1ml 山梨醇，涂平板（在摇床上培养 1h 后涂平板也可）；

3）MD 培养基生长 3-4 天，ROB 培养基上生长 4-5 天后，鉴定。

电击注意点

1）线性化质粒的含量在 1-5ug，纯度越高越好，量要有保证，很多人找不到阳性转化子可以考虑是否是这个因素造成；

2）感受态菌液收集，确定 OD 值在 1.2-1.5 之间，可以稀释不同倍数，判断是否是线性关系，菌液浑浊单 OD 值不高，可能是OD 稀释倍数不够；

3）感受态保存，感受态制备但其他还没处理好，冰上放置的时间对转化效率也会有影响，因此还是那个原则：现做现用；且分装成每次够用的量，一旦拿出就不在放回，也避免每次吸取造成污染；                                       

4）电击杯清洗，先洗净吹干，浸泡在 75%乙醇中，使用前超净台紫外灭菌，重复使用对实验也会有一定影响；

5）电击参数，电压及电击时间可以摸索，适当增加电压或延长电击时间，电击过程冰上操作

毕赤酵母原生质体法转化及感受态制备

原生质转化原理

酵母细胞具有细胞壁，细胞壁会组织其对外源 DNA 的摄入，因此，去除掉部分的细胞壁有利于酵母细胞对 DNA 的吸收。利用藤黄节杆菌酶（为一种葡聚糖酶），可以部分消化细胞壁。关键在于不能过度的消化细胞壁，否则将造成细胞死亡。藤黄节杆菌酶的消化能力受到 SDS 的影响，可以加入 SDS 对其消化进行控制，以得到消化适度的细胞。消化获得 70%的原生质细胞时，效果最好。

试剂配制

转化当天，配制如下溶液：

① SE：1M 山梨醇，25mM EDTA，pH8.0

② SCE：SE：1M 山梨醇，1mM EDTA，10mM 柠檬酸钠缓冲液，pH8.5

③ SOS：1M 山梨醇，0.3xYPD，10mM CaCl₂

④ CaS：1M 山梨醇，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM CaCl₂

⑤ DTT，PEG：DTT 水配制为 1M 浓度，PEG 用水配制 40%（w/v）

⑥ CaT：20mM Tris pH7.5，20mM CaCl₂

⑦ 藤黄节杆菌酶：用水配制成 3mg/ml 的浓度

⑧ 5%SDS 溶液，RD 融化琼脂 100ml，1M 山梨

醇每次转化时配制

① SED：19ml LSE 加 1ml DTT

② PEG/Cat：1:1 混合 40%PEG 及Cat 其他试剂

① YPD 培养基 1L，YPD 平板 1L

② RDB 平板 1L，RDHB 平板 1L
 

感受态制备及消化细胞壁

1）接种酵母受体菌单菌落于 YPD 平板，30℃培养 2 天；

2）挑取平板上的单菌落接种于 10mlYPD 液体培养基中，30℃摇床震荡过夜；

3）取培养的细胞 5ul，10ul，20ul 分别加入到含有 200mlLYPD 的液体培养基中，30℃震荡过夜（300rpm）；

4）第二天测每个培养瓶中的 OD600 值，并取出事先配置好的转化溶液，室温放置：

5）收集 OD600 值在 0.2-0.3 对应的培养瓶中的细胞，室温离心（1500rpm5min 左右），得到沉淀；如果没有培养瓶中的 OD 值在 0.3 左右的话，选择一个培养瓶，用新配置的培养基以 1：4 稀释，再次培养（2-3h 左右），直至出现OD 值为 0.2-0.3，收集细胞；

6）准备去除细胞壁，准备去壁试剂和待去壁的细胞；

7）准备去壁试剂：现配 SED，保证DTT（分析级）的新鲜度，配完放-20℃；

8）准备带去壁细胞：先用灭菌水清洗，转入离心管；1500rpm 离心 5min，收集细胞，用 20mlSED 重悬并洗涤离心；再次用 1M 山梨醇洗涤，离心（同上）；用SCE 重悬，分开至两个离心管中（每管 10ml 左右）；

9）准备藤黄节杆菌酶，取一管酶放置冰上，以上准备的两管细胞取出一管加入藤黄节杆菌酶，开始消化细胞（这一步可确定酶消化的最佳时间）；

最佳时间的确定

① 准备 20ml 5%SDS 溶液分光光度计调至 800nm，空白对照为 800ul 5% SDS 及 200ul SCE；

② 准备 10 个离心管，编号为 0，2，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，45，50（根据时间编号）；

③ 取上述 8 步中的另一管细胞，取出 200ul 加入至 0 号管中，放置冰上，此为 0 点；

④ 加入 7.5ul 藤黄节杆菌酶在剩余的细胞中，轻混，30℃孵育（不要晃动）用来建立最佳时间所用

⑤ 2min 时取 200ul 悬浮液至 2 号管中，同理 4，5，6，7，8min 时重复操作，读样品 OD800 值；

⑥  用公式计算细胞去壁的效率：%去壁率=100-{（T  时间  OD800-0  时间  OD800  值）x100} 10）

10）计算出去壁率为 70%左右时，得出最佳消化时间，同样操作加入 7.5ul 消化酶于另一管中消化细胞
11）室温离心去除悬浮液，1M 山梨醇洗涤一次，0.6mlCaS 悬浮细胞，立即转化，去壁的细胞应立即转化。

转化毕赤酵母

1）取 100ul 将去壁细胞，放入 1.5ml 离心管中（灭菌）；

2）准备 10ug 线性化质粒（预冷）与去壁细胞混合，加入 1ml 新鲜 PEG/Cat 溶液，轻混，室温孵育 10min；

3）室温 750rpm 离心 10min，去除 PEG/Cat 溶液；并用 150ulSOS 培养基悬浮转化细胞，室温孵育 20min；

4）加入 800ul 1M 山梨醇，涂平板；

5）取 200ul 转化细胞和 RD（液体）混匀倒于 RDB 平板上，凝固后导致平板，30℃培养 4-6 天，出现转化子；

6）取 100ul 稀释细胞，与 RDH（液体）混匀，涂在 RDHB 上，凝固后倒置生长，30℃培养 4-6 天，出现克隆， 表明去壁细胞可再次生长为分裂细胞。

阳性转化子的筛选与蛋白表达

Mut+和 Muts 表型的判断
待转化子在平板上生长一段时间后，进行 Mut+和 Muts 的筛选。挑取单克隆，在 MM 及 MD 培养基上划线或点（先在MM 平板上点，再在 MD 平板上点，一个克隆换一次牙签），30℃培养 2 天。观察，在MD 培养基上生长而在MM 培养基上不生长或长的很小即为 Muts 表型，其余为 Mut+表型。

Mut+的诱导表达

1）挑取单菌落，摇菌，在 25mlMGY 或 BMG 或 BMGY 培养基中，30℃，300rpm 培养至 OD600 为 2-6（培养15-18h 左右观察）；

2）室温 2000rpm 离心 5min，收集菌体，用上述培养基重悬，使 OD600 为 1.0 左右；将菌液至于 1L 摇瓶中，30℃300rpm 培养，每 24 小时加入 100%甲醇，至终浓度为 0.5-1.0%；

3）根据时间点取样（1ml）至于 1.5ml 离心管中，离心收集上清和菌体，分析蛋白表达量和最佳收获时间；

4）可以用 SDS-PAGE 和Western blot 进行分析鉴定表达情况。
 

Muts 的诱导表达

1）挑取单菌落，摇菌，在 25mlMGY 或 BMG 或 BMGY 培养基中，30℃，300rpm 培养至 OD600 为 2-6（培养15-18h 左右观察）；

2）室温 2000rpm 离心 5min，收集菌体，用上述培养基重悬，使 OD600 为 1.0 左右；将菌液至于 1L 摇瓶中，30℃300rpm 培养，每 24 小时加入 100%甲醇，至终浓度为 0.5-1.0%；

3）根据时间点取样（1ml）至于 1.5ml 离心管中，离心收集上清和菌体，分析蛋白表达量和最佳收获时间；

4）可以用 SDS-PAGE 和Western blot 进行分析鉴定表达情况。