蛋白纯化资料

His标签亲和纯化

多聚组氨酸标签(His-tag)介绍及亲和层析原理

       固定化金属离子亲合层析(Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC),简称金属螯合亲合层析,是一种新型的应用于原核蛋白纯化的技术。该方法通过蛋白质表面的一些特殊的氨基酸,使之与金属离子发      生相互作用,从而对蛋白质进行亲和纯化。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合等,其中以 6 个组氨酸残基组合的融合标签(His-Tag)在原核蛋白表达中的应用最为显著。

       His-Tag 可结合在目的蛋白的 C 末端或 N 末端,形成特殊的结构,以便于进行下一步的纯化及检测。由于金属螯合亲合层析具有配体简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点,所以可选择范围广,高盐,存在变性      剂以及去垢剂的上样条件下进行纯化,His-Tag 正逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。

His-tag 作为蛋白纯化时的首选标签,其优势在于:
1. N-端的 His-Tag 与细菌的转录翻译机制兼容,有利于蛋白表达;
2. 采用 IMAC(固定化金属离子亲合层析)纯化 His-Tag 融合蛋白操作更加简便;
3. His-Tag 对目的蛋白本身特性几乎没有影响,不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能;
4. His-Tag 非常小,在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响;His-Tag 的免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体;
5. 与其它亲和标签构建成双亲和标签,并可应用于多种表达系统;
        His-Tag 融合蛋白的适用范围也较广,既可以在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化,也可以在变性条件下进行纯化。前者通常用来纯化疏水性强的目的蛋白,而后者则通常纯化包涵体蛋白。

His-Tag 亲和层析填料
His-Tag 可与多种金属离子发生特殊的相互作用,如 Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+,Fe3+等,其原理是利用蛋白质表面的特性,使之被吸附在凝胶柱上,从而达到分离纯化蛋白的目的。

Ni2+在亲和纯化实验中的使用最为广泛。根据结合基团的不同,Ni2+亲和层析柱可分为俩类——Ni-IDA 和Ni-NTA。Ni2+有六个螯合价位,其中 Ni-IDA 螯合了三价,Ni-NTA 螯合了四价。所以 IDA 的载量要比 NTA 的高,在同样条件下 Ni-IDA 洗脱时的咪唑浓度也高于

Ni-NTA。但其弱的结合力使金属离子在洗脱阶段时很容 易浸出,与目的蛋白紧密结合,从而导致分离蛋白产量偏低,产品不纯及金属离子污染等问题。而 NTA 的颗粒粒度均匀,粒径更小,并且螯合镍更稳定,能耐受较高的还原剂,使填料更加稳定,镍离子不易脱落。

IMAC 在通常的情况下是比较稳定的,但螯合剂的存在则会导致其金属离子脱落。例如在 E.coli 的裂解液中普遍存在一些非特异的弱螯合剂,如在三羧酸循环中产生了二羧酸类物质。因此,E.coli 在某些高压情况下就会产生高特异性的金属螯合剂(通常存在于细菌的细胞周质中),导致 His-Tag 融合蛋白纯化的纯度和产量大大降低。所以在进行纯化 His-Tag 融合蛋白的实验时,首先需要去除螯合剂。

Ni-NTA 亲和层析实验
Ni-NTA 分离带 His 标签的重组蛋白

1. Ni-NTA 装柱,1.6×20cm,柱床体积为 10mL;
2. 用缓冲液 1 平衡 2~5 个床体积,流速为 2mL/min;
3. 将 20mL 细胞破碎液(50mM PBS,pH7.4,0.5M NaCl)0.45µm 滤膜过滤,上样,流速为 1mL/min;
4. 用缓冲液 1 再洗 2~5 个床体积,流速为 2mL/min;
5. 用分别含 10、20、50、100、200、300、400mM 咪唑的缓冲液 3 进行阶段洗脱,流速为 2mL/min,收集各阶段洗脱峰,用 SDS-PAGE 检测融合蛋白的分子量大小和纯度;
6. 用纯水流洗 5 个柱床体积,再用 20%的乙醇流洗 3 个柱床体积,流速为 2mL/min,柱子置于低温环境中保存。

缓冲液组成:
缓冲液 1

50mM pH7.4 的 PBS 缓冲液。配制:0.5M NaH2PO4 19mL,0.5M Na2HPO4 81mL,NaCl 29.3g, 加适量水溶解后定容到 1000mL。
缓冲液 2

50mM 磷酸盐缓冲液,pH7.4,即 pH7.4 的 PBS 溶液。配制:0.5M NaH2PO4 19mL,0.5M Na2HPO4 81mL, NaCl 29.3g 和咪唑 34g, 加适量水,调 pH 后定容到 1000mL。
缓冲液 3

不同咪唑浓度的缓冲液 B 配制:

咪唑浓度

缓冲液 1 量(mL)

缓冲液 2 量(mL)

10mM

98

2

50mM

90

10

100mM

80

20

200mM

60

40

300mM

40

60

400mM

20

80


咪唑洗脱原理
Ni 柱中的氯化镍可以与有 His-Tag 的融合蛋白结合,也可以与咪唑进行结合,当标签蛋白与层析柱表面珠孔内的镍离子介质发生结合时,不同浓度的咪唑通过层析柱,就会将与镍配位的标签蛋白,杂蛋白等分别洗脱下来,从而得到高纯度目标蛋白。

附录:Ni-IDA 和Ni-NTA 的一些参数对比

名称

Ni-IDA

Ni-NTA

参数

指标

基质

6%交联琼脂糖凝胶

配基

亚胺二乙酸(IDA)

次氮基三乙酸(NTA)

粒径

45~165 µm

60~169 µm

金属离子密度

40 µmol/mL

20-40 µmol/mL

载量

25-30mg 蛋白/mL

15mg 蛋白/mL

柱体积

1mL  5mL

1mL 或 5mL

柱尺寸(内径 x 高度)

0.9x1.57cm(1mL 柱子

0.9x1.57cm(5mL 柱子

0.6cmx2.8cm(1mL 柱子) 1.4cmx2.98cm(5mL 柱子)

 

推荐流速

mL/min(1mL 柱子) 5mL/min(5mL 柱子)

最高流速

4mL/min(1mL 柱子)
10mL/min(1mL 柱子)

20mL/min(5mL 柱子)
40mL/min(5mL 柱子)

最高耐压

0.3MPa(3bar)

0.5MPa(5bar)

>20mM 硫化试剂

避免使用的试剂

0.3MPa(3bar)

0.5MPa(5bar)

>20mM 硫化试剂

>10mM DTT

避免使用的试剂

螯合剂:EDTA、EGTA、柠檬酸等

螯合剂:EDTA、EGTA
阴离子去污剂

pH 稳定性

PH 2-14(短期,2h);PH 3-12(长期,7 天)