蛋白表达资料

酵母蛋白表达

酵母蛋白表达步骤/实验流程

       本文主要讲述了酵母蛋白表达步骤,详细酵母表达流程。从感受态细胞制备,转化方法选择及操作,从化学试剂PEG1000 转化,电击转化,原生质体法转化三个方法入手及转化子的筛选及最终的蛋白表达,全套酵母蛋白表达标准操作流程。

质粒线性化
在酵母表达系统中已经介绍了酵母蛋白表达原理,因此线性化是酵母转化的第一步,采用不同的限制酶酶切可以得到不同的表型。

转化方法

转化方法

转化效率

是否会多拷贝整合

操作

原生质体法

105

操作复杂

电穿孔法(电击)

105

操作方便

PEG 诱导转化

105

操作方便

 

毕赤酵母PEG1000 转化及感受态制备
配置缓冲液
1)缓冲液 A:1.0M 山梨醇,10mM 甘氨酸,pH8.35,3%(v/v)乙二醇,滤膜过滤,-20℃保存;
2)缓冲液 B:40%(w/v)PEG1000,0.2M 甘氨酸,pH8.35,滤膜过滤,-20℃保存;
3)缓冲液 C:0.15M NaCl,10mM 甘氨酸,pH8.35,滤膜过滤,-20℃保存;
4)未污染的新鲜、试剂级 DMSO,-70℃保存
将 DNA 直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞,其摄取外源 DNA 的能力也在解冻过程中迅速下降;样品的转化,进行多组试验。


感受态制备
1)接种酵母受体菌单菌落于 YPD 平板(YPD:蛋白表达试剂配置),30℃培养 2 天;

2)挑取平板上的单菌落接种于 10mlYPD 液体培养基中,30℃摇床震荡过夜;
3)过夜培养后按 1%左右的接种量接种到 100mlYPD 培养基中震荡培养至 OD 值从 0.1 至 0.5~0.8;
4)3000~5000rpm 离心收集沉淀菌体,用 50ml 预冷 A 液洗涤,并重悬与 4mlA 液中;
5)根据每次使用量(0.1-0.2ml 左右)分装与 1.5ml 离心管中,每管加入 10ul 的预冷 DMSO,混合后迅速-80℃
/液氮(感受态可以放到-80℃ ,但是酵母表达建议感受态现做现用)

酵母转化
1)线性化质粒 50ug(可预冷)溶于 200ul 的 TE 中,直接加入冻存的酵母感受态中;
2)37℃水浴 5min,过程混合样品 2 次;
3)取出加入 1.5ml 缓冲液 B,彻底混匀;
4)30℃水浴 1 小时;
5)室温 2000rpm 离心 10min,去上清,得沉淀,重悬菌体与 1.5ml 缓冲液 C 中;
6)再次离心,去上清,得沉淀,轻轻加入 0.2ml 缓冲液 C 重悬;
7)将重悬的转化液涂与选择性培养基(根据抗性配置)中,30℃孵育 3-4 天,进行鉴定。
毕赤酵母电击感受态细胞制备及转化

感受态制备
1)接种酵母受体菌单菌落于 YPD 平板,30℃培养 2 天;
2)挑取平板上的单菌落接种于 10mlYPD 液体培养基中,30℃摇床震荡过夜;
3)过夜培养后按 1%左右的接种量接种到 100mlYPD 培养基中震荡培养至 OD 值 1.2~1.5;
4)4℃,5000rpm 离心 5min 收集沉淀菌体,用 100ml 预冷无菌水重悬菌体;
5)4℃,5000rpm 离心 10min 收集沉淀菌体,用 100ml 预冷无菌水重悬菌体;
6)再次 4℃,5000rpm 离心 10min 收集沉淀菌体,用 100ml 预冷无菌水重悬菌体;
7)20ml,1mol/L 山梨醇洗涤 1 次;
8)将菌体溶于 200ul,1mol/L 预冷山梨醇中,不加甘油,-80℃放置几小时,待转化

酵母电转
1)准备好 80ul 的酵母感受态与线性化的质粒 1-5ug(冰上预冷 15min)混合,迅速放入 0.2cm 的电击杯中(电击杯冰上预冷灭菌),电击;
2)电击结束,迅速加入 1ml 山梨醇,涂平板(在摇床上培养 1h 后涂平板也可);
3)MD 培养基生长 3-4 天,ROB 培养基上生长 4-5 天后,鉴定。
电击注意点
1)线性化质粒的含量在 1-5ug,纯度越高越好,量要有保证,很多人找不到阳性转化子可以考虑是否是这个因素造成;
2)感受态菌液收集,确定 OD 值在 1.2-1.5 之间,可以稀释不同倍数,判断是否是线性关系,菌液浑浊单 OD 值不高,可能是OD 稀释倍数不够;
3)感受态保存,感受态制备但其他还没处理好,冰上放置的时间对转化效率也会有影响,因此还是那个原则:现做现用;且分装成每次够用的量,一旦拿出就不在放回,也避免每次吸取造成污染;                                      4)电击杯清洗,先洗净吹干,浸泡在 75%乙醇中,使用前超净台紫外灭菌,重复使用对实验也会有一定影响;
5)电击参数,电压及电击时间可以摸索,适当增加电压或延长电击时间,电击过程冰上操作

毕赤酵母原生质体法转化及感受态制备

原生质转化原理
酵母细胞具有细胞壁,细胞壁会组织其对外源 DNA 的摄入,因此,去除掉部分的细胞壁有利于酵母细胞对 DNA 的吸收。利用藤黄节杆菌酶(为一种葡聚糖酶),可以部分消化细胞壁。关键在于不能过度的消化细胞壁,否则将造成细胞死亡。藤黄节杆菌酶的消化能力受到 SDS 的影响,可以加入 SDS 对其消化进行控制,以得到消化适度的细胞。消化获得 70%的原生质细胞时,效果最好。

试剂配制
转化当天,配制如下溶液:
① SE:1M 山梨醇,25mM EDTA,pH8.0
② SCE:SE:1M 山梨醇,1mM EDTA,10mM 柠檬酸钠缓冲液,pH8.5
③ SOS:1M 山梨醇,0.3xYPD,10mM CaCl2
④ CaS:1M 山梨醇,10mM Tris-HCl,pH7.5,10mM CaCl2
⑤ DTT,PEG:DTT 水配制为 1M 浓度,PEG 用水配制 40%(w/v)
⑥ CaT:20mM Tris pH7.5,20mM CaCl2
⑦ 藤黄节杆菌酶:用水配制成 3mg/ml 的浓度
⑧ 5%SDS 溶液,RD 融化琼脂 100ml,1M 山梨醇每次转化时配制
① SED:19ml LSE 加 1ml DTT
② PEG/Cat:1:1 混合 40%PEG 及Cat 其他试剂
① YPD 培养基 1L,YPD 平板 1L
② RDB 平板 1L,RDHB 平板 1L

感受态制备及消化细胞壁                              
 1)接种酵母受体菌单菌落于 YPD 平板,30℃培养 2 天;
2)挑取平板上的单菌落接种于 10mlYPD 液体培养基中,30℃摇床震荡过夜;
3)取培养的细胞 5ul,10ul,20ul 分别加入到含有 200mlLYPD 的液体培养基中,30℃震荡过夜(300rpm);
4)第二天测每个培养瓶中的 OD600 值,并取出事先配置好的转化溶液,室温放置:
5)收集 OD600 值在 0.2-0.3 对应的培养瓶中的细胞,室温离心(1500rpm5min 左右),得到沉淀;如果没有培养瓶中的 OD 值在 0.3 左右的话,选择一个培养瓶,用新配置的培养基以 1:4 稀释,再次培养(2-3h 左右),直至出现OD 值为 0.2-0.3,收集细胞;
6)准备去除细胞壁,准备去壁试剂和待去壁的细胞;
7)准备去壁试剂:现配 SED,保证DTT(分析级)的新鲜度,配完放-20℃;
8)准备带去壁细胞:先用灭菌水清洗,转入离心管;1500rpm 离心 5min,收集细胞,用 20mlSED 重悬并洗涤离心;再次用 1M 山梨醇洗涤,离心(同上);用SCE 重悬,分开至两个离心管中(每管 10ml 左右);
9)准备藤黄节杆菌酶,取一管酶放置冰上,以上准备的两管细胞取出一管加入藤黄节杆菌酶,开始消化细胞(这一步可确定酶消化的最佳时间);

最佳时间的确定

① 准备 20ml 5%SDS 溶液分光光度计调至 800nm,空白对照为 800ul 5% SDS 及 200ul SCE;
② 准备 10 个离心管,编号为 0,2,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,40,45,50(根据时间编号);
③ 取上述 8 步中的另一管细胞,取出 200ul 加入至 0 号管中,放置冰上,此为 0 点;
④ 加入 7.5ul 藤黄节杆菌酶在剩余的细胞中,轻混,30℃孵育(不要晃动)用来建立最佳时间所用
⑤ 2min 时取 200ul 悬浮液至 2 号管中,同理 4,5,6,7,8min 时重复操作,读样品 OD800 值;
⑥  用公式计算细胞去壁的效率:%去壁率=100-{(T  时间  OD800-0  时间  OD800  值)x100} 10)计算出去壁率为 70%左右时,得出最佳消化时间,同样操作加入 7.5ul 消化酶于另一管中消化细胞
11)室温离心去除悬浮液,1M 山梨醇洗涤一次,0.6mlCaS 悬浮细胞,立即转化,去壁的细胞应立即转化。

转化毕赤酵母
1)取 100ul 将去壁细胞,放入 1.5ml 离心管中(灭菌);
2)准备 10ug 线性化质粒(预冷)与去壁细胞混合,加入 1ml 新鲜 PEG/Cat 溶液,轻混,室温孵育 10min;
3)室温 750rpm 离心 10min,去除 PEG/Cat 溶液;并用 150ulSOS 培养基悬浮转化细胞,室温孵育 20min;
4)加入 800ul 1M 山梨醇,涂平板;
5)取 200ul 转化细胞和 RD(液体)混匀倒于 RDB 平板上,凝固后导致平板,30℃培养 4-6 天,出现转化子;
6)取 100ul 稀释细胞,与 RDH(液体)混匀,涂在 RDHB 上,凝固后倒置生长,30℃培养 4-6 天,出现克隆, 表明去壁细胞可再次生长为分裂细胞。

阳性转化子的筛选与蛋白表达

Mut+和 Muts 表型的判断
待转化子在平板上生长一段时间后,进行 Mut+和 Muts 的筛选。挑取单克隆,在 MM 及 MD 培养基上划线或点(先在MM 平板上点,再在 MD 平板上点,一个克隆换一次牙签),30℃培养 2 天。观察,在MD 培养基上生长而在MM 培养基上不生长或长的很小即为 Muts 表型,其余为 Mut+表型。

Mut+的诱导表达
1)挑取单菌落,摇菌,在 25mlMGY 或 BMG 或 BMGY 培养基中,30℃,300rpm 培养至 OD600 为 2-6(培养
15-18h 左右观察);
2)室温 2000rpm 离心 5min,收集菌体,用上述培养基重悬,使 OD600 为 1.0 左右;将菌液至于 1L 摇瓶中,
30℃300rpm 培养,每 24 小时加入 100%甲醇,至终浓度为 0.5-1.0%;
3)根据时间点取样(1ml)至于 1.5ml 离心管中,离心收集上清和菌体,分析蛋白表达量和最佳收获时间;
4)可以用 SDS-PAGE 和Western blot 进行分析鉴定表达情况。

Muts 的诱导表达
1)挑取单菌落,摇菌,在 25mlMGY 或 BMG 或 BMGY 培养基中,30℃,300rpm 培养至 OD600 为 2-6(培养
15-18h 左右观察);
2)室温 2000rpm 离心 5min,收集菌体,用上述培养基重悬,使 OD600 为 1.0 左右;将菌液至于 1L 摇瓶中,
30℃300rpm 培养,每 24 小时加入 100%甲醇,至终浓度为 0.5-1.0%;
3)根据时间点取样(1ml)至于 1.5ml 离心管中,离心收集上清和菌体,分析蛋白表达量和最佳收获时间;
4)可以用 SDS-PAGE 和Western blot 进行分析鉴定表达情况。

酵母表达原理

      本文主要讲述了毕赤酵母蛋白表达的原理,毕赤酵母表达能够高效表达的机制。
      巴斯德毕赤酵母(以下简称毕赤酵母)能够高效表达外源基因,是因为其有更强的强启动子,即醇氧化酶启动子PAOX。甲醇营养型酵母能将甲醇分解为甲醛和过氧化氢,在此反应中参与的酶是醇氧化酶(AOX1 和 AOX2)。其中,AOX2 的表达量比 AOX1 低得多,以甲醇为唯一碳源时,AOX1 增至细胞总蛋白的 40%。PAOX1 受甲醇诱导和葡萄糖或甘油的抑制。因此,AOX1 的表达受到甲醇的严格控制。
      巴斯德毕赤酵母所表达的外源基因位于酵母染色体上,这是通过把携带外源基因的表达质粒线性化,以同源重组的      方式整合到强启动子 PAOX1 的下游,目的基因一般插入到 5’AOX1 启动子和转录终止子之间的单克隆位点。

毕赤酵母蛋白表达系统

1. 酵母表达宿主菌Mut+和 Muts
在毕赤酵母表达系统中,乙醇氧化酶有两种基因编码,即 AOX1 和 AOX2。细胞中绝大多数乙醇氧化酶活力有 AOX1 提供,菌株利用甲醇的速度主要由 AOX1 基因表达的 AOX1 蛋白提供。当 AOX1 缺失,只存在 AOX2 时,大部分的乙醇氧化酶活力丧失,这种细胞利用甲醇能力低,在甲醇培养基上生长缓慢的菌株表现型为 Muts。存在 AOX1, 细胞利用甲醇正常生长,在甲醇培养基上生长较快,这种菌株表现型为 Mut+,这就是甲醇营养型毕赤酵母表达两种 Muts 和 Mut+产生的原理。
酵母表达系统常用宿主菌
GS115、KM71、SMD1168 是常用的表达宿主菌,均为甲醇诱导型。他们都是组氨酸缺陷型,如果表达载体上带有组氨酸基因,可以补偿宿主菌的组氨酸缺陷,所以可以在不含组氨酸的培养基上筛选重组转化子。在以葡萄糖或者甘油等为碳源的培养基上生长时,AOX1 基因的表达受到抑制,而在以甲醇为唯一碳源时,宿主菌的 AOX1 基因被强烈诱导,使目的基因大量表达。
有无甲醇诱导产生的 Mut+和 Muts 表现型
毕赤酵母的最适生长温度为 28-30℃,诱导期间超过 32℃,不利于蛋白表达,并可能导致细胞死亡。Muts 和 Mut+ 菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率一样,存在甲醇的情况下,AOX1 启动子被强烈诱导,Mut+较 Muts 生长更快(4-5 倍)。

1. 酵母蛋白表达载体
酵母蛋白表达载体的选择
酵母表达产物有胞内表达和分泌到胞外表达两种方式,这取决于表达载体的选择和构建是否带有信号肽,可根据基      因表达的定位及目的选择合适的酵母蛋白表达载体。
① 胞内表达载体:主要包括 pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2 等。该类载体将目的基因表达在胞内,可避免酵母的糖基化,适合于通常在胞浆表达或不含-S-S-的非糖基化蛋白,较胞外分泌表达水平高但纯化相对复杂。
② 分泌到胞外表达的载体:pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P 等。酵母本身分泌的外源蛋白很少,将外源蛋白分泌到胞外,有利于目的蛋白的纯化和积累。常用的分泌信号序列由 89 个氨基酸组成α交配因子的引导。
③ 多拷贝插入表达载体:pPIC9K、pPIC3.5K。某些情况下,重组基因的多拷贝整合能够增加蛋白的表达量。

表达重组蛋白使其具体天然的 N 端
想实现表达重组蛋白使其具体天然的 N 端,将目的基因直接连接在 Kex2 蛋白酶切位点之后。Kex2 蛋白酶切位点在信号肽序列中谷氨酸和精氨酸连接处:Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala *位置为 Kex2 蛋白酶的酶切位点

毕赤酵母表达系统机制/原理
毕赤酵母能够高效的表达外源基因,是因为其具有强启动子乙醇氧化酶启动子(AOX1 和 AOX2)。AOX1 和 AOX2 及其产生的 Muts 和 Mut+表现型前文已经叙述过。AOX1 受甲醇的诱导和葡糖糖或甘油的抑制。毕赤酵母表达的外源基因位于酵母染色体上,通过把构建的质粒/载体线性化(主要采用酶切),通过同源重组的方式整合到启动子 AOX 的下游,一般是插入到 5’AOX 启动子和转录终止子信号之间的单克隆位点。