北大曾克武/屠鹏飞教授团队在国际学术期刊Advanced Science上发表了题为“Allosteric Activation of Transglutaminase 2 via Inducing an ‘Open’ Conformation for Osteoblast Differentiation”的研究论文，本文基于点击化学构建毛喉素的小分子活性探针，从小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中“钓”出其直接作用靶点谷氨酰胺转移酶2（TGM2），深入阐明了天然活性小分子化合物毛喉素（forskolin）治疗骨质疏松的分子靶点及作用机制。

研究背景

·成骨细胞在骨稳态调节中起关键作用，其功能障碍可导致严重骨骼疾病。

·毛喉素（FSK）是传统药用植物毛喉鞘蕊花的代表性活性成分，具有一定的促成骨分化的作用，表明对其骨质疏松症等骨病具有潜在的治疗作用

·谷氨酰胺转移酶2（TGM2）是一种多功能酶，有研究表明TGM2可以诱导成骨细胞分化并改善骨量减少和抑制破骨细胞数的增多，但尚未有研究报道候选药物靶向TGM2促进成骨细胞分化和骨重建。

研究方法

·使用FSK作为化学探针，通过合成含有光亲和标签和点击化学手柄的FSK分子探针（AD-FSK）来识别细胞靶点。

·通过多种生物化学和生物物理学方法（如SPR分析、LC-MS/MS、分子动力学模拟等）研究FSK与TGM2的相互作用。

其中鉴定FSK的直接作用靶点

基于点击化学合成，液相色谱串联质谱鉴定FSK作用靶点，通过表面等离子体共振实验、Pull-down实验、CETSA实验、DARTS实验证明了毛喉素直接与MC2T3-E3细胞中的TGM2结合。

ABPP：

探针合成：研究人员合成了带有光亲和标记和点击化学手柄的FSK探针（AD-FSK），用于在细胞内捕获TGM2及其相互作用蛋白。

光亲和标记：将AD-FSK与MC3T3-E1细胞共同孵育后，通过UV照射诱导探针与靶蛋白形成共价键。

点击化学反应：利用点击化学反应将生物素-PEG-叠氮化物或5-TAMRA-叠氮化物连接到探针标记的蛋白质上。

亲和纯化与质谱分析：通过链霉亲和素磁珠富集标记的蛋白质，并进行液相色谱-串联质谱分析（LC-MS/MS），以鉴定与TGM2相互作用的蛋白质。

SPR:

通过SPR分析，研究人员发现FSK能够直接与TGM2结合，解离常数（Kd）为3.1 μM，表明FSK与TGM2之间存在中等强度的结合。

CETSA-WB

在CETSA实验中，研究人员发现FSK处理后的MC3T3-E1细胞中，TGM2的热稳定性显著增强，表明FSK与TGM2结合后改变了其构象，使其更加稳定。

总结：

·ABPP用于鉴定与TGM2相互作用的蛋白质，揭示了TGM2在成骨细胞分化中可能涉及的分子机制和信号通路。

·SPR技术直接验证了FSK与TGM2之间的结合，并测定了结合亲和力。

·CETSA-WB技术通过评估TGM2的热稳定性变化，间接证明了FSK与TGM2的结合及其对TGM2构象的影响。

这些技术的综合应用为深入理解TGM2在成骨细胞分化中的作用及其变构激活机制提供了有力的实验证据。

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