药物靶点筛选是现代药物研发的核心环节，而有限蛋白水解-质谱联用技术（LiP-MS） 凭借其无需探针修饰和原位捕捉蛋白构象变化的能力，已成为该领域的重要突破。以下从技术原理到前沿应用进行系统解析：

一、技术原理：蛋白构象稳定性的质谱解码

当小分子药物与靶蛋白结合时，会通过氢键等非共价作用稳定蛋白结构，使其对抗蛋白酶水解的能力显著增强。LiP-MS利用这一特性，通过三步实现靶点筛选：

有限酶解：在生理条件下用广谱蛋白酶（如蛋白酶K）处理药物-蛋白复合物，未结合蛋白被高效切割，而结合蛋白因构象稳定得以“保护”。

差异肽段生成：药物结合区域的蛋白酶切位点暴露减少，产生实验组特有的完整肽段（如案例中油酸结合的ENO1蛋白的R47-R67肽段）。

质谱定量分析：通过高分辨质谱（如4D-DIA/Tims-TOF）检测实验组与对照组的肽段丰度差异，定位潜在靶点及结合域，分辨率可达12个氨基酸。

关键创新点：相较于传统方法（如化学探针修饰），LiP-MS直接在生理环境下捕获天然构象的蛋白-药物相互作用，避免了因修饰导致的活性失真。

二、技术流程与核心优势

实验流程标准化

样本制备：使用细胞裂解液或组织提取总蛋白（需避免变性剂）

药物孵育：小分子与蛋白在生理缓冲体系中孵育（通常15分钟-2小时）

两步酶解：先经蛋白酶K有限水解，再用胰蛋白酶完全消化

质谱检测：LC-MS/MS定量分析差异肽段（如4D-DIA可提升检测深度）

技术优势显著：

无需修饰：直接使用原药物分子，保留其天然活性

多维度数据：同时获取蛋白丰度变化与构象变化信息

高分辨率：可精确定位到单个功能结构域（如金丝桃素结合Dlat蛋白的C末端结构域）

广适用性：适用于变构调节、酶-底物复合物等多种作用类型

局限性：对蛋白序列覆盖率要求较高（需>30%），且动态构象可能干扰位点识别。

三、应用场景：从靶点发现到机制解析

1. 药物靶点发现

案例1-代谢物靶点：通过LiP-MS筛选出油酸结合靶点ENO1（烯醇化酶1）和异胆酸靶点FXR1，经SPR验证结合力（KD=10.6μM/32.9μM）。

案例2-天然产物抗肥胖机制：鉴定出金丝桃素（HPF）直接结合二氢硫辛酰胺乙酰转移酶（Dlat），激活AMPK-PGC1α轴以促进脂肪褐变。

2. 结合位点分析

针对已知靶点（如纯化重组蛋白），LiP-MS可解析药物结合域。例如在衰老研究中，锁定谷氨酸合成酶Glt1的聚合界面，突变该区域可恢复氨基酸稳态并延长寿命。

3. 多组学整合研究

结构-功能关联：结合转录组/代谢组数据，揭示靶点调控网络（如酵母衰老中Glt1聚合与线粒体功能障碍的关联）。

脱靶效应筛查：高通量检测非目标蛋白结合情况，评估药物安全性。

四、方法学比较：LiP-MS vs DARTS

二者均为免标记靶点筛选技术，但存在显著差异：

五、技术演进与未来方向

仪器创新：4D-质谱（timsTOF HT）提升检测灵敏度与肽段覆盖率

算法优化：分子对接模拟（如Autodock Vina）辅助验证结合位点，降低假阳性

活体应用：开发体内LiP-MS（in vivo LiP），直接在动物模型中捕捉药物-靶点互作

临床转化：整合疾病生物标志物筛选（如神经退行性疾病中淀粉样蛋白构象变化）

如2021年《Cell》研究所述，LiP-MS已实现单细胞水平蛋白动态结构监测，为精准药物设计提供新范式。

LiP-MS凭借其原位捕捉蛋白构象变化的能力，重塑了药物靶点筛选的逻辑框架。随着高分辨质谱与计算模拟的深度融合，该技术有望在变构药物开发和多靶点系统药理研究中释放更大潜力，推动药物研发从“经验筛选”迈向“数据驱动”的新阶段。

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