骨关节炎是一种常见衰老性疾病，全球有超过3亿患者。截止目前，尚无安全有效可延缓病情进展的治疗药物。因此，需进一步明确骨关节炎的发病机理和潜在干预靶点并研发安全有效新药。

近日，中南大学湘雅医院国家老年疾病临床医学研究中心雷光华教授团队在在骨关节炎发病机理与临床防治领域取得的重要研究成果，发现强心甾类药物地高辛具有保护软骨细胞、延缓软骨退变的作用，并首次证实LRP4是地高辛的直接作用靶点。研究以“Digoxin targets low density lipoprotein receptor-related protein 4 and protects against osteoarthritis”为题发表于该领域的顶级期刊Ann Rheum Dis（IF 19.103）。

该研究针对1046种FDA认证的药物进行筛选，将这些药物处理C3H10T1/2间充质干细胞，24h后qRT-PCR定量Col2a1（软骨ECM组成部分）mRNA表达，发现20种药物有效增加Col2a1表达（图1A），其中哇巴因效果最为显著。之后将20种药物处理C28I2软骨细胞24h进行第二轮筛选，同时加入了哇巴因的同类药物（卡多内酯类）lanatoside C，cymarin和地高辛，发现哇巴因和地高辛显著促进与软骨细胞分化相关的基因的表达（图1B）。因此使用哇巴因和地高辛进行进一步的实验，发现地高辛能够在体外诱导软骨形成（图1C），在体内预防小鼠骨关节炎发生（图1D）。随后通过开展大样本临床调研，首次发现服用地高辛与接受人工关节置换手术率的降低显著相关（图1E）。最后通过Western Blot发现地高辛通过ERK1/2、AKT和NF-κB信号通路激活软骨细胞合成代谢（图1F）。

图1卡多内酯药物（哇巴因和地高辛）可预防骨关节炎

为了研究地高辛的直接作用靶点，研究人员通过DARTS 技术（drug affinity responsive target stability）分析发现LRP4是地高辛最可能作用的靶点（图2A），通过Western Blot（图2B）和细胞热迁移实验（CETSA）（图2C）进行了证实。进一步的分子对接显示地高辛的羟基作为氢键供体与LRP4的Phe236、Asp239、Asp342、Glu343 和Asn348的侧链相互作用（图2D），突变上述位点中的Glu-343后结合能力降低（图2E），表明地高辛通过靶向LRP4的关键氨基酸Glu-343发挥功能。最后，研究人员通过体内外实验发现骨关节炎患者相对于健康对照组LRP4表达显著下调（图2F），而地高辛能够通过逆转LRP4下调，且敲除LRP4以后，地高辛不再保护发挥作用（图2G）。总之，研究表明地高辛通过靶向LRP4的关键氨基酸Glu-343发挥软骨保护作用。

图2 LRP4是卡多内酯药物（哇巴因和地高辛）的直接作用靶点

总结与讨论

该研究同时进行了药物开发和靶点确认的工作，首先通过现有药物数据库进行老药新用，发现了强心甾类药物地高辛能够预防骨关节炎，随后发现了地高辛的新的直接作用靶点。研究不仅为明确地高辛的软骨保护作用及其具体机制提供了理论依据，也为进一步开发治疗骨关节炎的相关药物提供了新思路。

文章的研究思路值得借鉴，而针对于文章中的一些技术手段，我们可以有着更多的选项。

1）文章确定地高辛的骨关节炎预防作用后，采用Western Blot筛选发现ERK1/2、AKT和NF-κB信号通路是地高辛激活软骨细胞合成代谢的关键通路，这里针对于信号通路的筛选，磷酸化抗体芯片无疑是一个非常好的选择，可一次性实现多达31条信号通路的全面筛选。

2）文章确定地高辛的直接作用靶点采用的是DARTS 技术，20K人类蛋白质组芯片作为简便、快速和准确的药物靶点筛选实验技术同样是一个非常好的选择，该蛋白芯片可以分析经过荧光、生物素、放射性同位素标记的小分子与~2万种人类全长蛋白质的结合情况，判断候选分子的结合靶点和特异性。

研锦生物专注于先导化合物、抗体药物、药物靶点的发掘；其次也为靶向药物筛选提供前期CRO服务，面向全球科研院所、高校、医院以及药企等科研机构。公司主要有以下平台：计算机辅助药物设计平台；SPR药物动力学检测平台；重组蛋白、抗体表达平台；以及细胞动物检测药效、毒理等实验平台；致力于靶向药物的前期开发筛选。